Uji Salmonella

A. Deskripsi

Uji Salmonella digunakan untuk menetapkan adanyaSalmonella dalam makanan. Salmonella merupakan bakteri gram-negatif berbentuk tongkat yang menyebabkan tifus, paratifus, dan penyakit foodborne. Salmonella terdiri dari sekitar 2500 serotipe yang kesemuanya diketahui bersifat pathogen baik pada manusia atau hewan.

Bakteri ini bukan merupakan indikator sanitasi, melainkan bakteri indikator keamanan pangan . Artinya, karena semua serotipe Salmonella yang diketahui di dunia ini bersifat patogen maka adanya bakteri ini dalam makanan dianggap membahayakan kesehatan. Oleh karena itu berbagai standar makanan siap santap mensyaratkan tidak ada Salmonella dalam 25 gram sampel makanan.

 

B. Kegiatan Belajar

1. Tujuan Pembelajaran

Setelah melakukan kegiatan belajar ini, diharapkan siswa dapat:
a. Menerapkan konsep dan prinsip cara pelaporan hasil pemeriksaan Salmonella pada bahan pangan
b. Melakukan pemeriksaan Salmonella pada bahan pangan

2. Uraian Materi

a. Salmonella

Salmonella merupakan salah satu bakteri yang sering menyebabkan penyakit yang serius apabila mencemari makanan maupun minuman yang dikonsumsi manusia. Salmonella juga dapat hidup pada tubuh makhluk hidup yang berdarah dingin maupun berdarah panas. Bakteri ini bukan indikator sanitasi, melainkan bakteri indikator keamanan pangan . Artinya, karena semua serotipe Salmonellayang diketahui di dunia ini bersifat patogen maka adanya bakteri ini dalam makanan dianggap membahayakan kesehatan. Oleh karena itu berbagai standar makanan siap santap mensyaratkan tidak ada Salmonelladalam 25 gram sampel makanan.

Secara morfologi, bakteri Salmonella mempunyai karakteristik gram negatif, berbentuk batangdiameter 0,7 – 1,5 μm, memiliki panjang 2 – 5 μm, tidak membentuk spora, dan bersifat aerob/fakultatif aerob.Salmonella memiliki kekerabatan yang dekat dengan bakteri genus Escherichia dan dapat dijumpai hampir di seluruh dunia.

Berikut adalah klasifikasi dari Bakteri Salmonella:
Phylum/Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Enterobacteriales
Keluarga : Enterobacteriaceae
Genus : Salmonella
Species : S. enterica

Salmonella dapat memfermentasi glukosa dengan membentuk asam atau gas dan dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit. Salmonella mudah tumbuh pada kebanyakan media. Namun ada empat jenis media spesifik yang digunakan untuk memilah Salmonella dari mikroba lainnya,yaitu :

1) Media agar Bismuth Sulfite

Media ini merupakan media yang sangat spesifik untuk isolasi Salmonella typhii dan spesies lain. Adanya bismuth sulfite dan brilliant green dapat menghambat pertumbuhan gram positif dan koliform. Adanya Sulfit dalam media akan diubah menjadi H2S yang berperan dalam mengendapkan besi, sehingga koloni berwarna coklat hitam dengan kilap logam. Media ini sangat cocok digunakan pada tahap awal untuk memilahkan Salmonella dari mikroba lain. Sedangkan mikroba lain yang tumbuh terutama Pseudomonas dapat dipilah dengan media lain.

Gambar: Salmonella typhii dalam media Bismuth Sulfit Agar

2) Media Brilliant Green Agar

Media ini mengandung brillian green yang sangat baik untuk menghambatpertumbuhan e coli dan bakteri yang memfermentasi sukrosa dan laktosa. Garam empedu berperan menghambat bakteri untuk batang gram negatif. Media ini sangat selektif untuk isolasi Salmonella sp. Salmonellatyphii akan berwarna merah dikelilingi zona merah. Bakteri lain yang akan menyerupai Salmonella adalah bakteri Pseudomonas. Untuk menetapkan apakah itu Salmonella atau Pseudomonas, diperlukan konfirmasi dengan media lain.

Gambar: Salmonella typhii dalam media Brillian Green Agar

3) Media Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar

Media ini digunakan untuk isolasi Salmonella dan memilah organisme lain dengan cara memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S. fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme enteric kecuali Shigella, Provindencia, dan Edwardsiella. Pada media ini, Salmonella akan membentuk koloni merah dengan inti hitam, sedangkan Pseudomonas tumbuh dengan warna merah dan Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter, Klebsiella, dan Citrobacter. Namun, media ini kurang tepat jika digunakan pada tahap awal identifikasi Salmonela, sehingga media ini lebih baik digunakan untuk tahap konfirmasi kontaminan Salmonella.

Gambar: Media Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar (kiri) dan Media Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar yang ditumbuhi Salmonella

4) Triple Sugar Iron Agar

Triple Sugar Iron Agar merupakan media diferensial yang terdiri dari laktosa, sukrosa, dekstrosa, fero sulfat, dan indicator pH phenol red. Media ini digunakan untuk memilah mikroorganisme yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi sulfur dan memfermentasi karbohidrat. Dengan adanya fermentasi phenol red, jika mikroorganisme tidak dapat memfermentasi ketiga jenis gula (sukrosa, laktosa, glukosa) yang ada dalam media, maka media akan berubah menjadi warna kuning. Jika mikroorganisme hanya dapat memfermentasi dekstrosa, sebagian kecil dekstrosa yang tersisa dalam media digunakan oleh mikroorganisme dalam 10 jam pertama proses inkubasi. Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning.

Gambar: Salmonella Typhimurium dalam Media TSIA
http://www.austincc.edu/microbugz/triple_sugar_iron_agar.php

5) Hektoen Enteric Agar merupakan media selektif diferensial.

Media ini terdiri dari bile salt agar yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif, sehingga diharapkan hanya Salmonella yang tumbuh pada media ini. Media ini juga digolongkan sebagai media diferensial karena dapat membedakan bakteri Salmonella dengan bakteri lainnya dengan cara memberikan tiga jenis karbohidrat pada media, yaitu laktosa dengan komposisi tertinggi, glukosa, dan salisin. Salmonella tidak dapat memfermentasi laktosa sehingga asam yang dihasilkan sedikit karena fermentasi hanya berasal dari glukosa. Hal ini yang menyebabkan Salmonella berwarna hijau kebiruan karena asam yang dihasilkan bereaksi dengan indicator yang ada pada media yaitu fuksin asam dan bromtimol blue.

Gambar: Media Hektoen Enteric Agar (kiri) dan Salmonella dalam media Hektoen Enteric Agar

Pada gambar tersebut dapat kita lihat bahwa media yang ditumbuhi Salmonella terdapat titik hita pada koloni bening Salmonella. Titik hitam tersebut merupakan hasil dari fermentasi karbohidrat berupa H2S. Seluruh spesies akan menunjukkan hasil yang serupa kecuali Salmonella typhii yang memproduksi H2S dalam jumlah yang sedikit.

b. Prosedur Uji Salmonella

Untuk melakukan deteksi cemaran Salmonella pada produk makanan, ada beberapa metoda yang direkomendasikan untuk digunakan oleh industri maupun laboratorium analisa lainnya. Salah satunya adalah metoda yang diterbitkan oleh Badan Standarisasi Internasional, yaitu Standar ISO 6579 : 2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Salmonella spp.

Gambar: Metoda ISO 6579:2002 untuk Deteksi Salmonella

Sumber.http://www.merckmillipore.co.id/chemicals/analisis-bakteri salmonella-menggunakan-media-kultur-bismuth-sulphite-agar/c_.hWb.s1O7pYAAAEkiloksZ5a

Dalam metoda ISO 6579 : 2002 ini terdiri dalam tiga tahapan, tahap pertama adalah pre-enrichment, tahap kedua adalah selective enrichment, dan tahap ketiga adalah isolasi pada media agar selektif. Tahap pre-enrichment menggunakan media kultur cair yaitu Buffered Peptone Water (BPW). Pre-enrichment pada media kultur cair berfungsi untuk memperbaiki kondisi bakteri yang injured.Tahapan kedua adalah melakukan selective enrichment pada 2 jenis media kultur cair, yaitu Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS) dan Muller Kaufman Tetrathionate Novobiocin Broth. Pada tahapan selective enrichment ini terjadi optimalisasi pertumbuhan Salmonella dan dihambatnya pertumbuhan bakteri-bakteri penyerta lainnya yang dapat menggangu pertumbuhan Salmonella, sehingga dapat semakin meminimalkan hasil false negatif. Tahap ini menggunakan 2 jenis media selektif yang bertujuan untuk memaksimalkan pertumbuhan dari berbagai spesies Salmonella yang mungkin terdapat pada sampel. Sebab, terkadang beberapa jenis spesies Salmonella dapat tumbuh baik pada media kultur RVS namun tidak dapat tumbuh pada MKTTn, maupun sebaliknya.

Tahapan ketiga adalah melakukan isolasi atau plating pada media agar selektif yaitu XLD agardan Rambach Agardengan metoda streak/gores menggunakan jarumose. Pada media XLD agar, Salmonella akan menggunakan kandungan xylose, laktosa, dan sukrosa menjadi zat asam yang menyebabkan phenol red berubah menjadi kekuningan atau oranye. Salmonella juga akan menghasilkan hydrogen sulfit sebagai hasil dari pemanfaatan thiosulfate dan garam besi (III) yang menyebabkan koloni Salmonella berwarna hitam.

Gambar: XLD agar (kiri) dan Koloni Salmonella dalam XLD agar (kanan)
Sumber.http://pictures.life.ku.dk/atlas/microatlas/veterinary/plating_media/XLD

Pada media Rambach Agar, Salmonella akan tumbuh dan tampak sebagai koloni berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh pemanfaatan propylene glycol dan reaksinya dengan pH indikator yang menghasilkan warna merah. Media Rambach Agar mengandung substrat chromogenic untuk mendeteksi aktifitas pemecahan β-galactosidase oleh Coliform, sehingga dapat dibedakan antara Salmonella dengan bakteri Coliform lainnya.
Pertumbuhan coliform pada media Rambach Agar akan tampak sebagai koloni yang berwarna kehijauan atau biru-violet. Sedangkan bakteri dari kelompok Gram-negatif lainnya akan tampak sebagai koloni yang tak berwarna, misalnya Proteus dan Shigella.

Gambar: Koloni Salmonella pada Rambach agar (kiri) dan koloni e coli pada rambach agar (kanan)

Contoh lain dalam pengujian Salmonella adalah identifikasi Salmonella pada sampel mayonnaise pada (SNI 01-4473-1998) dengan syarat negative jika jumlah koloni 25 gr.

Prosedur pengujian deteksi Salmonellasesuai dengan SN-01-2332.2-2006 tentang Tahap-Tahap Uji Salmonella. Tahap uji ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu

1) Pra-Pengkayaan

Metode ini diawali dengan pengambilan sampel seberat 25 gr atau 225 ml dengan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan media pengkayaan (lactose broth). Selanjutnya contoh yang akan diuji dimasukkan ke dalam wadah plastik yang telah disterilkan dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth (LB). Selanjutkan homogenkan sampel selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan contoh dalam wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur.

Gambar: Sebelum dan Sesudah Proses Pra-Pengkayaan

Silahkan anda amati gambar proses sebelum dan sesudah proses pengkayaan. Diskusikanlah dengan teman kelompok anda, apa yang menyebabkan perubahan warna. Reaksi apa yang terjadi pada proses tersebut.

2) Tahap Pengkayaan

Tahap pengkayaan diawali dengan mengencangkan tutup wadah dan mengkocok perlahan contoh yang diinkubasi. Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, Selanjutnya pindahkan 0,1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB

Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:
inkubasi pada RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C (Water bath);
Inkubasi pada TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C (Water bath);
inkubasi pada TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C (Inkubator).

Gambar: Isolasi bakteri dari media pra-pengkayaan ke media pengkayaan

3) Tahap Inkubasi

Tahap ini diawali dengan mengocok tabung (dengan vortex) dan dengan mengggunakan jarum ose (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang sama dari RV Broth atau SCB. Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati kemungkinan adanya koloni Salmonella.

4) Pengamatan Morfologi Salmonella

Pengamatan morfologi Salmonella dilakukan dengan mengambil 2 atau lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agar selektif setelah 24 jam± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) adalah sebagai berikut:

* Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.

* Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
* Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau hitam; kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam (haloeffect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.

Gambar: Koloni positif pada media selektif HE (atas), BSA (kiri), dan XLD (kanan) (gambar kanan) dan koloni negatif pada media yang sama (gambar kiri)

Metode lain dalam pengujian adalah dengan uji biokimiadan uji serologi. Dalam pengujian ini dibuat kontrol positif yaitu sampel yang telah diberi biakan kultur Salmonella sebagai pembanding. Dari pengkayaan selektif, biakan dari MKTTn dan RVS diinokulasikan pada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan identifikasi. Pada tahap ini hanya biakan dari BGA yang berasal dari MKTTn yang menunjukkan pertumbuhan koloni. Sedangkan pada media XLD tidak ada pertumbuhan koloni. Selanjutnya koloni dari biakan BGA dilakukan uji identifikasi yaitu uji biokimia dan uji serologi. Uji biokimia yang dilakukan antar lain sebagai berikut :

a. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula. Media yang diguanakan dalam uji TSIA ini adalah TSIA agar yang mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga terdapat indicator fenol merah yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakteri lainnya.Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang terlihat

Pada uji TSIA warna media berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa Perubahan warna media ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam.

b. Uji urease

Uji urease digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba menghidrolisis urea menjadi amonia. Uji ini menggunakan urease broth sebagai media diferensial yang dapat membedakan bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim yang berfungsi untuk menghidrolisa urea menjadi ammonia. Kandungan urease broth antara lain larutan buffer, urea, nutrient, serta indicator phenol red.

Uji urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan warna media dari kuning menjadi merah keunguan karena amoniak yang dihasilkan menyebabkan lingkungan menjadi basa. Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan.

c. Uji Dekarboksilasi Lysin

Uji Dekarboksilasi Lysin menggunakan media Xylose-Lysine- Desoxycholate. Agar medium digunakan untuk isolasi Salmonelladanmemilah organisme lain dengan cara memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S. Fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme enterik kecuali, Shigella, Providencia,Edwardsiella. Pada media ini, Salmonellaakan membentuk koloni merah dengan inti hitam, sedang Pseudomonas dapat tumbuh dengan warna merah dan Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter, Klebsiella,Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang dapat tumbuh, sehingga media ini kurang dapat memilah Salmonellapada tahap awal. Sehingga lebih baik digunakan untuk tahap konfirmasi kontaminan Salmonella.

d. Uji β-galaktosidase

Uji β-galaktosidase digunakan utuk identifikasi beberapa jenis bakteri seperti Salmonella. Enzim β-galaktosidase merupakan enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon. Selain laktosa, substrat alamiah dari enzim, adalah bahan yang sangat penting, ONPG (o-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside), dapat digunakan pula. Β-galaktosidase dapat mengkatalisis ONPG menjadi galaktosa dan o-nitrofenol. ONPG tidak berwarna tetapi setelah hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada larutan yang alkali. beberapa jenis bakteri yang mampu melakukan fermentasi terhadap karbohidrat Streptococcus, Lactobacillus, Zygomonas, Saccharomycetes, Escherichia, Enterobacter, Salmonella.

e. Uji Indol

Uji Indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri dalam memecah asam amino triptofan. Media ini biasanya digunakan dalam indentifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.

f. Uji Voges Proskauer

Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis bakteri Untuk membedakan bakteri Escherichia coli dengan Enterobacteraerogenes. Hasilnya uji ini negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan a-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin).

Selain uji biokimia, juga terdapat uji serologi untuk mengidentifikasi adanya Salmonella dalam banhan pangan. Dalam uji serologi tidak terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi . Jika hasil dari uji biokimia dan uji serologi contoh atau sampel berbeda dengan hasil kontrol positif, maka koloni yang tumbuh dari biakan BGA pada contoh bukanlah Salmonella, sehingga hasil dari pengujian ini dapat dinyatakan sebagai negatif koloni/25 gr. Hasil ini telah memenuhi syarat seperti pada SNI 01-4473-1998 yang mensyaratkan cemaran Salmonellapada mayonnaise adalah negatif koloni/25 gr.

Salmonellapositif jika pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya sebagai berikut:

• TSIA : butt (+), slant (-), gas positif atau negatif dan H2S positif atau negatif.
• Hidrolisis urea : negatif
• Dekarbosilasi lysine : positif
• Reaksi voges proskauer : negatif
• Produksi indol : negatif
• Uji serologi: terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi.

g. Uji Biokimia Tambahan

Uji biokimia tambahan dapat dilakukan jika pada biakan masih diragukan adanya Salmonella atau tidak. Tahapan uji biokimia tambahan adalah sebagai berikut:

a) Purple Lactose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol red lactose atau purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Hasil dinyatakan positif jika terjadi pembentukan asam (media berubah kuning) dan ditemukan gas pada tabung durham. Selain itu jika hanya terjadi pembentukan asam saja, sudah dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonellamemberikan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

b) Purple Sucrose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonellamemberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna
merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

c. Medium MR-VP

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

d. Uji VP

Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok. Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit Kristal kreatin, dan amati hasilnya setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif.Umumnya Salmonella memberikan reaksi VP negatif.

e. Uji MR

Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera. Umumnya Salmonellamemberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning menunjukkan reaksi negatif.

f. Simmon Citrat Agar

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar miring dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Hasil dinyatakan positif apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warnadari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan hasil citrate positif. Namun jika tidak ada atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna, maka hasil dinyatakan negatif.